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O folding de proteínas I

  Esta imagem é um trabalho derivado de: 1. LadyofHats derivative work: Gabby8228 (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Main_protein_structure_levels_en.svg) [released into the Public domain], via Wikimedia Commons. *AND* 2. Zephyris: O <em>folding </em> de proteínas I at the English language Wikipedia [GFDL (www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC-BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)], via Wikimedia Commons.

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As proteínas…

Uma proteína é uma molécula resultante da ligação química – ligação peptídica – de vários aminoácidos. À sequência de aminoácidos que compõe esta cadeia polipeptídica (várias ligações peptídicas) chama-se estrutura primária.

Figura 1. Principais níveis de organização estrutural das proteínas. Esta imagem é um trabalho derivado de: 1. LadyofHats derivative work: Gabby8228 (Main_protein_structure_levels_en.svg) [Public domain], via Wikimedia Commons. *AND* 2. Zephyris at the English language Wikipedia [GFDL (www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC-BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)], via Wikimedia Commons.
Figura 1. Principais níveis de organização estrutural das proteínas.
Esta imagem é um trabalho derivado de: 1. LadyofHats derivative work: Gabby8228 (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Main_protein_structure_levels_en.svg) [released into the Public domain], via Wikimedia Commons. *AND* 2. Zephyris: O <em>folding </em> de proteínas I at the English language Wikipedia [GFDL (www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC-BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)], via Wikimedia Commons.

A hélice-alfa (hélice-α) e a folha-beta (folha-β) constituem as configurações mais frequentes que a proteína pode apresentar. Estas configurações, juntamente com as interacções electrostáticas entre os átomos de oxigénio e os átomos de hidrogénio (ligações por pontes de hidrogénio), constituem as estruturas secundárias. As interacções entre as estruturas primária e secundária designam-se por estruturas terciárias. Por exemplo as interacções entre as estruturas hélice-alfa e folha-beta. A estrutura terciária constitui, em geral, a conformação tridimensional (3D) final de uma proteína – conformação nativa – à qual está associada uma função biológica específica. A estrutura quaternária consiste na interacção de estruturas terciárias que se juntam formando uma nova proteína. Por outras palavras, uma estrutura quaternária é ainda uma conformação final 3D composta por várias conformações finais 3D – uma proteína formada por várias proteínas. A hemoglobina (Figura 1.) é um exemplo de uma estrutura quaternária composta por quatro estruturas terciárias, quatro unidades proteicas (duas hélice-α e duas folha-β) e as correspondentes ligações por pontes de hidrogénio. As várias sub-unidades da hemoglobina  interagem originando uma conformação final específica e única, à qual está associada a sua função biológica. (Ler um pouco mais sobre hemoglobina…)

Afinal o que é o folding de proteínas?

Na realidade folding é a palavra inglesa para designar enrolar e dobrar. O folding de proteínas consiste no processo espontâneo de enrolamento e dobragem de uma sequência linear de aminoácidos. Este processo é determinado pela sequência de aminoácidos e das interacções existentes entre eles. Como foi referido acima, a estrutura 3D resultante é única, determina e define a sua função biológica…como o caso da hemoglobina.

Hum…função biológica? Hemoglobina? Isto sugere que estas estruturas específicas podem ser importantes…

Na realidade são muito importantes…sabe-se que podem ocorrer ‘erros’ durante o folding de uma proteína originando uma conformação que não corresponde à chamada conformação nativa. Como se pode antecipar, neste caso, a sua função biológica pode sofrer alterações com consequências significativas, como por exemplo no desenvolvimento e funcionamento de organismos. Voltando ao caso da hemoglobina: uma conhecida alteração de um aminoácido na sequência de aminoácidos, resultante de um ‘erro’ genético, é suficiente para causar uma alteração do processo folding desta proteína, dando origem a uma conformação diferente da conformação nativa. Esta modificação é suficiente para causar alterações da função biológica podendo originar doenças como é o caso da anemia falciforme. Neste tipo de anemia, o folding defeituoso (misfolding) da proteína causa uma alteração da forma das células hemácias, ou glóbulos vermelhos, que passam a ter a forma de foice (daqui o nome anemia falciforme), com eventuais consequências no bem estar do organismo afectado. Existem ainda casos em que uma produção anormalmente elevada de proteínas que ‘foldaram’ incorrectamente se depositam em tecidos ou órgãos. Desta situação pode resultar numa alteração do normal funcionamento (insuficiência) ou na total paragem da actividade dos tecidos ou orgãos. Este é o caso de um conjunto de diversas patologias designadas por amiloidoses (à proteína ‘misfolded’ chama-se amilóide). A proteína em causa e os órgãos e tecidos afectados definem os sintomas e o tipo de amiloidose em questão. Ler mais...

A Polineuropatia Amiloidótica Familiar ou Doença dos Pezinhos é um exemplo de uma amiloidose de transmissão genética, neste caso causada pela acumulação sistémica (pode afectar vários orgãos e tecidos, vários sistemas) de amilóides associadas à proteína transtirretina. Esta doença é também conhecida por Doença Corino de Andrade, nome do neurologista que primeiro a descreveu e identificou, nos anos 1950s. Nem todas as amoiloidoses têm uma origem hereditária como é o caso da amiloidose AL (primária), actualmente sem origem ou causas conhecidas, ou o caso da amiloidose AA (secundária), que se pode manifestar em pessoas com história de doença inflamatória ou infecciosa crónica prolongada (ex. artrite reumatóide). Uma ligação em inglês com bastante informação sobre as várias amiloidoses: http://www.amyloidosis.org.uk/ A manifestação da Doença de Alzheimer está sempre associada à acumulação de placas amilóide em certas regiões do cérebro. As causas da Doença de Alzheimer não foram ainda estabelecidas. Em particular, não é ainda conhecido se a formação das placas amilóide são causa ou consequência do desenvolvimento da doença.
 

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Figura 2. Mecanismos de doenças relacionadas com o ‘folding’de proteínas (em inglês).  Mechanisms of protein-folding diseases at a glance, Julie S. Valastyan and Susan Lindquist, Dis. Model. Mech. January 2014, doi: 10.1242/dmm.013474 vol. 7 no. 1 9-14. http://dmm.biologists.org/content/7/1/9.full

De referir ainda que certos tipos de cancro resultam especificamente de um incorrecto folding das proteínas codificadas pelos designados genes supressores de tumores, ou oncogenes (um pouco mais aqui),  em particular responsáveis pela regulação da divisão celular. Sob certas condições, uma pequena alteração genética pode desencadear a produção de proteínas defeituosas que, tendo a sua função biológica alterada (inactivada por exemplo), afecta os mecanismos de controle de divisão ou de morte celular.

 O folding de proteínas

Como foi referido acima, uma proteína apenas se torna funcional quando adquire a sua forma 3D (estrutura terciária). Esta estrutura terciária não se consegue determinar de forma simples, de modo que esta informação é conhecida para apenas cerca de 10% das proteínas. Das experiências levadas a cabo por Christian Anfinsen e os seus colegas, nos anos 60, observou-se que: 1. A proteína usada (ribonuclease) pode ser ‘desnaturada’ mudando o ambiente químico, ou apenas aquecendo a solução. 2. O processo de desnaturação pode ser revertido completamente apenas pela reintrodução da proteína no ambiente inicial ou apenas baixando a temperatura. Neste caso a proteína ‘folda‘ para o seu estado 3D natural e biologicamente funcional. Isto levou à construção da Hipótese Termodinâmica, e que valeu  a Christian Anfisen o Prémio Nobel da química em 1972 (Nobel Lecture) 1. O processo de folding ocorre de forma espontânea conduzindo a um estado nativo. O estado nativo corresponde ao estado mais estável ou de mais baixa energia, do ponto de vista termodinâmico. 2. A estrutura nativa da proteína é determinada pela sequência de aminoácidos e a totalidade de interacções entre os aminoácidos que a compõem.

Mas…qual é o problema do folding?

Uma questão central no folding de proteínas é saber como é que de uma sequência de aminoácidos como a estrutura primária passa à estrutura terciária, numa escala que pode variar do segundo ao pico-segundos. Cyrus Levinthal propôs que no processo de folding uma proteína colapsa para a sua estrutura nativa sem  efectuar uma passagem por todas as configurações possíveis. Esta afirmação baseava-se num simples resultado obtido a partir de uma experiência conceptual. Aqui, será ainda simplificada…(Ler mais…a versão apresentada por C. Levinthal) suponha-se que se tem uma pequena proteína composta por 100 aminoácidos e que cada aminoácido pode encontrar-se em apenas um de dois estados. O número de conformações possíveis acessíveis a uma cadeia de aminoácidos nestas condições é 2100≅ 1030. Considerando que a escala de tempo típica de uma vibração térmica é 1 ps, o tempo que levaria a experimentar o número total de configurações seria 1030  ps ≅ 4.0 × 1010 anos. Ora a idade do universo (estimada) é de cerca de 1.4 × 1010 anos de onde se depreende que a passagem para a estrutura nativa não pode implicar uma passagem por todos os estados possíveis de forma aleatória. Este problema ficou (e é!) conhecido como o paradoxo de Levinthal. Uma abordagem proposta por Levinthal passou por considerar que existem vários estados intermediários que constituem um caminho preferido (único) de folding. Aqui Levinthal propõe que o estado final nativo não corresponde ao estado de energia mais baixo do ponto de vista termodinâmico, ao invés corresponde ao estado de mais baixa energia mas de um ponto de vista cinético. A existência de estados intermediários demonstrou-se não ser necessária com a descoberta (1991) de um proteína que folda sem passar por nenhum estado intermediário. E agora?…Parece que as abordagens de Anfinsen e de Levinthal não se conciliam…O estado nativo corresponde ao estado mais estável ou de mais baixa energia, do ponto de vista termodinâmico ou cinético? A ‘procura’ deste estado é aleatória? Existirá um caminho único? Num próximo artigo falar-se-á de algumas abordagens que desde então têm sido consideradas na resolução do problema de folding. Entretanto, fica aqui a referência a dois projectos que podem ajudar a ‘pragmatizar’ o problema e formas de o tentar resolver: Folding@homeFoldit….e…

…talvez ajudar?

Importa referir que o estudo de um problema tão complexo e exigente como é o folding de proteínas não teria, e não seria, certamente possível sem o paralelo desenvolvimento da capacidade computacional das máquinas que hoje existem. (Será suficiente?…) Como uma das formas que podemos utilizar para ajudar a entender o processo de folding, e como este processo pode ‘falhar’ (misfolding), é recorrendo a métodos computacionais, talvez possamos ajudar o projecto  de computação distribuída Folding@home (wiki). ligação para o projecto: (en) https://folding.stanford.edu/ (pt) http://folding.stanford.edu/Portuguese/HomePage

O <em>folding </em> de proteínas I
Figura 3. Foldit. (http://fold.it/portal/).

Uma outra abordagem é adoptada pelo projecto Foldit (http://fold.it/portal/). Este projecto apresenta uma panóplia de puzzles que podem ser abordados por qualquer pessoa. O objectivo é ‘ajudar’o computador a aprender as  várias estratégias humanas individuais e utilizá-las no estudo do folding de proteínas. Figura 3. Foldit (http://fold.it/portal/).


Este post foi parcialmente motivado por um trabalho realizado no âmbito da cadeira de Física Computacional (com o meu colega Rui P.), leccionado pela Professora Patrícia Faísca, na Faculdade de Ciências de Lisboa (2006). Adicionalmente, o texto foi ainda inspirado em

Outras referências:

Magnetic Resonance Imaging (MRI) Physics

This article is a version of section 1.6 – Chapter 1, of my doctoral thesis, Functional MRI of stimulus interference on auditory processing in normal listeners and tinnitus patients available @ http://hdl.handle.net/10362/14989, (minor wording modifications were applied).

Professor Bloch has told you how one can detect the precession of the magnetic nuclei in a drop of water. Commonplace as such experiments have become in our laboratories, I have not yet lost a feeling of wonder, and of delight, that this delicate motion should reside in all the ordinary things around us, revealing itself only to him who looks for it.

 E. M. Purcell – Nobel Lecture: Research in Nuclear Magnetism (Purcell, 1953).

fMRI is a technique that allows the production of images of the human brain, and identify which regions are active as response to stimulus variations or presentations. It is a considerably safe technique, and since it is non-invasive it became a privileged way to study the human brain. It has good spatial resolution of the order of millimeters, however the nature of the signal that it is measured limits the temporal resolution to the order of seconds.

MRI physics: the spin, the magnetic field and the radio frequency coils

MRI physics is based on the concept of nuclear magnetic resonance (NMR) first described in 1946 by Felix Bloch (Bloch, 1946; Bloch et al., 1946), by Edward Purcell (Purcell et al., 1946), and their respective colleagues. To have NMR we need a non-zero spin atomic nuclei (Nuclear), a strong magnetic field (Magnetic), and a radio frequency coil (Resonance).

The spin

‘Spin’ is a property of some particles that causes the nuclei to possess a magnetic moment and an angular momentum. Because the nuclei have angular momentum, they will experience an effect called precession, a motion analogous to a spinning top. Precession consists of a circular movement of the rotation axis of the spin, about a second axis of an existing external field (e.g. a magnetic field B), causing the spin axis to change its direction. (Figure 1-A)

Our body is made of different tissues, and all tissues contain water molecules. One water molecule consists of one oxygen and two hydrogen atoms. 16-oxygen and 18-oxygen nuclei do not possess magnetic moment, thus do not interact with an existing magnetic field.  However, 17-oxygen does have a magnetic moment, but its abundance in the human body is very low when compared to hydrogen (Haacke et al., 1999). Consisting of a single proton, each of the hydrogen nucleus has a magnetic moment associated to its spin. This means an enormous amount of hydrogen nuclei in our body are spinning, making this a good candidate nucleus to study, using NMR. (Figure 1-B)

The magnetic field B0

In the case of MRI, a strong superconducting magnet is used to create the strong magnetic field B0 to cause the nuclei to precess in turn of a known direction.

In the presence of an external magnetic field, the nuclei will precess in turn of the applied field. Because the proton has only two energy states, the nuclei will tend to align with the external field in a parallel or anti-parallel way – the two important states called spin-up or spin-down, low and high energy states respectively. (Figure 1-C) At room temperature the low and high precessing states are more or less balanced, however there will be a slightly higher proportion of nuclei in low than high. As a result, a tiny majority of spins will tend to align in the lower energy state thereby creating a net magnetization (M0) of all the nuclei in the direction of the main magnetic field, B0. (Figure 1-D)

The net magnetization can be considered in terms of one big spin, and it constitutes the basis of the imaged signal. The behavior of individual spins can only be described by quantum mechanical equations, however a classical description is suitable for the net magnetization vector behavior.

It is necessary to reorient the nuclei out of alignment with B0, and consequently the net magnetization so that the precession can be observed. As the nuclei then fall back in alignment with the main magnetic field, they will release signals that the MRI can detect. In order to reorient the nuclei and to detect the released signal radio frequency coils (RF) are needed.

Figure 1: Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
Figure 1: Nuclear Magnetic Resonance (NMR). A. A spinning particle precesses in turn of an axis at a Larmor frequency. B. If not acted upon an external field, the hydrogen nuclei are randomly oriented. C-D. The nuclei tend to align parallel in relation to an applied magnetic field B0. Although there is a percentage of particles that align in an antiparallel manner, there is a non-zero resultant net magnetization M0. E. M0 can be flipped into the transverse plane by applying an RF pulse. F. M0 relaxes back to equilibrium, precessing to the longitudinal plane and emitting a signal that can be picked up by the receiver coils.
The radio frequency (RF) coils

Radio frequency coils are used to produce an electromagnetic field (the RF pulse). This pulse has to be applied perpendicular to the field B0 for the magnetization vector to be deviated from its initial alignment with B0. The RF coils can also be used to receive the signal that is transmitted back from the sample.

The RF pulse is applied at the Larmor frequency of the particle, which in the case of the hydrogen nucleus with one proton and an applied external field of 3T is ∼128 MHz. This will be the required frequency of the applied RF pulse for the proton to resonate (resonance frequency) and allow an energy state transition. If the pulse is applied for long enough the net magnetization vector is flipped out of the longitudinal plane into the transverse plane and a 90° RF pulse (excitation) is said to have been applied. (Figure 1-E) Next, what it is needed in NMR imaging is to reorient the net magnetization vector to its natural state of precession. Therefore, the RF pulse is turned off and a signal can be detected by the RF receiver coil.

In time the spin will experience a returning to the alignment with the B0, and the longitudinal magnetization (M||) component will grow back to equilibrium. This process is called longitudinal relaxation and involves spin-lattice interactions – energy exchange of the spin with the lattice. The growth rate of M|| is characterized by the time constant T1, which for the case of brain tissue is in the order of 1 s. However, not all the protons are bound in their molecules in the same way. This is different for each tissue. T1 depends on the applied magnetic field strength (the longer for stronger magnetic fields).

However, the MRI signal of interest is the signal released by the precession movement of the transverse magnetization during its return to equilibrium. This signal is detected by a receiver coil tuned to the Larmor frequency of the proton. There is the return to equilibrium of the transverse magnetization, M, by a process called spin-spin relaxation. (Figure 1-F)

Each nucleus magnetic field interacts with the other nuclei causing them to precess at a different frequencies (loss of coherence between spins), a process also known as ‘dephasing’ of the spins.  (Figure 2)

This results in a signal loss characterized by a time constant T2 (different from the longitudinal relaxation T1). For brain tissue, T2 is in the order of 0.1 s. Additionally, M decay is caused by variations in local field, or field inhomogeneities that are experienced by the spin nuclei, which affect the transverse relaxation time to a T2* < T2. Therefore, T2* is a combination of T2 dephasing effects and field inhomogeneities. However, by applying an additional RF pulse so that the spins are 180° flipped in the transverse plane, the T2* dephasing can be reversed and the external field dispersion refocused. This is called spin-echo sequence, and the time between the 90° pulse and the spin-echo is known as echo time (TE). The spin-echo process can be repeated several times allowing the acquisition of enough signal so to construct an image. Instead, gradient echo sequences can be used in a process that consists of causing a transverse dephasing and subsequent refocus of the spins. This is achieved with additional coils used to produce a magnetic field that varies in three orthogonal directions – the magnetic field gradients. This also allows the MRI the capacity to image directionally along the three orthogonal axis, which is the basic principle of MRI.

Dephasing of the nuclei.]{Dephasing of the nuclei. Each nucleus precess at a different frequency causing loss of coherence between the spins.
Figure 2: Dephasing of the nuclei.]{Dephasing of the nuclei. Each nucleus precess at a different frequency causing loss of coherence between the spins.

 

The period of time that exists between successive excitation pulse sequences (two 90° RF pulses) applied to the same slice is called repetition time (TR). TR will determine how much the longitudinal magnetization recovers in this time interval. Various combinations of the parameters can be used to obtain distinct images. Echo-planar imaging (EPI) consisting of a pulse sequence involving multiple dephasing and refocusing gradient-echo sequences can be used to obtain the MRI images. This, consists of the appropriate method for T2*  image construction, where the signal decay depends on local field inhomogeneities, which is the property of interest in blood oxygenation level-dependent (BOLD) fMRI.

References

1. Purcell, E. M. Research in nuclear magnetism. Science 118, 431–436 (1953). [Nobel Lecture @ http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1952/purcell-lecture.html]

2. Bloch, F. Nuclear Induction. Phys. Rev. 70, 460–474 (1946). (APS) (pdf)

3. Bloch, F., Hansen, W. W. & Packard, M. The Nuclear Induction Experiment. Phys. Rev. 70, 474–485 (1946). (APS) (pdf)

4. Purcell, E. M., Torrey, H. C. & Pound, R. V. Resonance Absorption by Nuclear Magnetic Moments in a Solid. Phys. Rev. 69, 37–38 (1946). (APS) (pdf)

5. Haacke, E. M., Brown, R. W., Thompson, M. R. & Venkatesan, R. Magnetic Resonance Imaging: Physical Principles and Sequence Design. (Wiley, 1999).

Additional online resources

The basics of NMR,  J.P. Hornak http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/

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